摘要：近在SARS-CoV-2臨床試驗中mRNA疫苗的成功應用一部分歸功于納米顆粒脂質體遞送系統的開發，該系統不*在肌肉注射后有效表達mRNA編碼的免疫原，而且作為佐劑和疫苗反應發揮作用。我們概述了mRNA遞送系統，并重點介紹了目前SARS-CoV-2疫苗臨床試驗中使用的納米顆粒脂質體。這篇綜述文末分析了基因疫苗中納米顆粒脂質體性能的決定因素。
簡介
由于COVID-19在全球的大流行，mRNA疫苗被推到了生物技術和制藥工業的中心舞臺。由BioNTech/輝瑞、Moderna、CureVac、Sanofi/TranslateBio、Arcturus/Duke-NUS新加坡醫學院、倫敦帝國理工學院、泰國朱拉隆功大學和Providence Therapeutics領導的mRNA疫苗人體試驗共有8個正在進行。
值得注意的是，其中兩項試驗已經公布了3期臨床中期結果，報告了接種2次30 µg或100 µg劑量LNP包裹的編碼刺突蛋白免疫原的mRNA序列后，病毒感ran率降低94%以上。疫苗開發的速度也遠超出了預期，在SARS-CoV-2序列*公開后10個月就有了如此**的效果。這一成功不*證明了生物技術和制藥業有應對緊急和緊缺的全球性需求的能力，也證明了mRNA作為一種藥物的所具有的能力，在中mRNA作為一種預防性疫苗。本綜述的目的是概述mRNA遞送系統的發展、總結SARS-CoV-2 mRNA疫苗的臨床前和臨床發現，并將其與其成功的遞送系統特征聯系起來。近有幾篇早于爆發的關于疫苗和zhi療mRNA遞送系統的的優綜述已經發表。
與小分子、DNA、寡核苷酸、病毒系統和蛋白質，包括抗體等的其他藥物形式相比，mRNA療法具有許多優勢和幾個難點。與寡核苷酸和大多數小分子藥物有限的靶點相比，mRNA可以調節刺激和抑制作用方式，也能夠表達或替換缺陷蛋白，這擴大了其使用的潛在適應癥范圍。
與DNA相比，mRNA只需要獲得細胞質的核糖體翻譯機制而不用進入細胞核，因此沒有整合到人體基因組的風險。與蛋白質和病毒系統相比，mRNA的制造是在細胞外快速制備的，并且蛋白質產物具有天然的糖基化和構象性質。當與脂質納米顆粒(LNP)遞送系統結合時，mRNA LNP的納米結構特性也與病毒系統和循環的內源性含脂質乳糜微粒的大小、脂質包膜和內部基因組物質等方面具有相似性，并且有助于其作為疫苗和其他zhi療藥物的遞送載體材料。
mRNA的難點在于其先天的免疫原性，對酶降解的敏感性以及細胞對裸露的mRNA攝取幾乎可以忽略不計。mRNA的先天免疫原性是由于toll樣受體(TLRs)、解旋酶受體(包括視黃酸誘導基因I (RIG-I)樣受體(RLRs)等)對單鏈和雙鏈RNA的識別，然后這些受體通過NF-κB和干擾素(IFN)調節因子IRF3和IRF7發出信號并轉位到細胞核，與I型IFN基因啟動子結合，誘導I型IFN(IFN-α和IFN-β)的表達，并伴有促炎細胞因子產生，如**壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-12（IL-12）。分泌的干擾素作為一種病毒防御機制，通過其受體和同一細胞及相鄰細胞中的JAK/STAT途徑發出信號，**300多個受干擾素刺激的基因，包括蛋白激酶PKR。
雖然這種**可能有利于對mRNA疫苗產生免疫反應，但直接作用是通過eIF2a的PKR磷酸化來下調翻譯，這樣損害了eIF2的活性，抑制了mRNA翻譯，從而抑制了免疫原的蛋白質合成。消除這種先天免疫反應的主要方法是將天然存在的核苷如1-甲基二脲苷和核糖體RNA(通常不在mRNA中)中存在的其他核苷替換到mRNA序列中，這使得它不能被先天免疫傳感器檢測到。這種核苷修飾的免疫應答mRNA是mRNA技術的基礎，該技術近在BioNTech/輝瑞和Moderna疫苗試驗中顯示了超過94%的有效性，這些技術是建立在對其他病原體試驗的基礎上，下文將詳細描述。
由于TLR7和TLR8主要識別富含GU的單鏈RNA序列，CureVac采用了第二種方法包括密碼子優化和盡量不使用鳥苷酸。mRNAzhi療的第二個難點是其對核酸酶的敏感性，例如在它血清中的半衰期< 5分鐘。盡管siRNA的化學修飾在提高穩定性和降低免疫原性方面非常成功，但迄今為止，由于翻譯機制對化學修飾的敏感性，使得它們在mRNA修飾并不成功。mRNA的第三個難點是大多數細胞類型（除不成熟的樹突細胞外）缺乏對裸露的mRNA的細胞攝取吸收。
后兩個難點可以通過將核苷修飾或mRNA導入適宜遞送系統來解決，這樣既保護mRNA免受核酸酶的攻擊，又促進細胞攝取。比如，當在動物模型中給藥時，與裸露的mRNA相比，加入納米顆粒脂質體可保護mRNA免受核酸酶的攻擊，并增強細胞攝取和表達高達1000倍。
質粒DNA主鏈通過體外轉錄(IVT)產生zhi療性mRNA，其帶有5’端的帽子結構、5’端的非翻譯區(UTR)、編碼目的蛋白開放閱讀框、3’端UTR和polyA尾。天然真核生物的5’端帽子(cap0)是一種倒置的7-甲基鳥苷(m7G)，通過5’-5’三磷酸鹽與mRNA的**個核苷酸相連。
Cap0保護內源性mRNA免受核酸酶攻擊，參與核輸出，與翻譯起始因子4結合，啟動蛋白質翻譯。另外兩個5’端帽子結構被證實(帽子1和帽子2)在第二個或第三個核糖核苷酸上含有額外的甲基，其免疫原性低于cap0(因此更佳)。目前常用的加帽方法包括共轉錄加帽，產生具有高翻譯和低免疫原性的帽子1。5’端UTR參與翻譯起始，包含一個Kozak序列以及一個非帽依賴翻譯的核糖體進入位點。開放閱讀框之后是3’端UTR，它影響mRNA的穩定性和蛋白質表達的持久性。polyA尾在大約100個殘基上編碼，有助于啟動翻譯和延緩降解。體外轉錄（IVT）生產的mRNA需要經過純化，以去除具有免疫原性的DNA和雙鏈RNA污染物。
上述的mRNA可以是核苷修飾的，也可以是未經核苷修飾的序列，但不能進行自我復制。能夠復制的自擴增mRNA (samRNA)也正在進行臨床試驗測試，其長度約為10 kb，由于它們有四個額外編碼的非結構基因，包括一個RNA依賴的RNA聚合酶，導致了細胞內的自復制，但由于缺乏結構基因，不會產生感ran性粒子。
samRNA不能被核苷修飾，因為這些修飾會干擾自身擴增。在目前的臨床試驗中，由于samRNA的擴增過程，其通常使用較低的劑量(1-10 µg)，而非擴增的mRNA則需使用30-100 µg。表1總結了目前所有上述類別在進行人體臨床測試的mRNA疫苗。這些臨床試驗中的所有mRNA遞送系統都是納米顆粒脂質體。
BioNTech/輝瑞LNP和Moderna LNP已經公開其確切方，而其他一些公司尚未公開。其他產品很可能與Alnylam公司的 OnpattroTM產品相似(下文將進一步描述)，就像已經公開的產品，可能都包含用的可電離脂質。雖然所用的特定可電離脂質可能未知，但其常用種類可以從期刊和**出版物中了解，如表1所示。
表1：目前在進行人體臨床測試采用納米顆粒脂質包裹的mRNA疫苗總結如下。臨床試驗中的所有mRNA疫苗都使用納米顆粒脂質體進行遞送。其類別和組成尚未公開，因此基于現有文獻和**，它們可能的類別如下所示。
在之前，mRNA疫苗用于傳染病的臨床前和臨床研究，包括流感、寨卡病毒、艾zi病毒、埃博拉病毒、狂犬病、基孔肯雅病毒、瘧疾、生殖器皰疹、弓形蟲等。這些研究被總結在近的一些綜述中。
COVID-19
SARS-CoV-2
LNP：脂質納米顆粒
CNE:陽離子納米乳劑
NLC納米結構脂質載體
PBAE：聚β氨基酯
PACE：聚(胺-共-酯)
Epo
hPBAE：超支化聚β-氨基酯
PEI：聚乙烯亞胺
pABOL：二硫化物連接的聚酰胺基胺
SPLP：質粒-脂質顆粒
SNALP：核酸脂質顆粒
IFN：干擾素
HAI：血凝抑制試驗
CVnCoV：CureVac mRNA LNP
mAbs：單克隆抗體
VHH:Vh結構域
M2e:基質蛋白2外域
Tfh：濾泡輔助T細胞
